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第五章 免疫荧光试验程序
第一节 间接免疫荧光试验
一、 抗原制备
1、 固定细胞片的制备：
生长在盖片上的细胞（接种或未接种病毒），可直接收获盖片，在PBS中洗涤，用4℃100％丙酮固定2分钟，空气干燥，置密封容器于—20℃保存备用；单元细胞 悬液可在盖片上制成涂片，固定方法同上。
2、 单细胞 悬液制备：
用含0。1—1％BSA和0。1％的叠氮钠的PBS洗2—3次。注意所有各步需在4℃进行！经细胞 计数，调节细胞 浓度至10（7）/ml，可供作活细胞 的膜荧光染色。
3、 细菌涂片的制备：
将10ul细菌悬液（1X10（6）个/ml）涂沫7X21mm盖玻上，自然干燥后，用—20℃丙酮固定10—15分钟，于—20℃保存备用。
4、 病变组织触片的制备，按常规方法。
5、 病变组织冰冻切片的制备。
二、抗体染色及结果观察
1、 盖片在去离子水中湿润后置架上滴加10—20ul杂交瘤上清或其它待检样品，设立阳性、阴性对照。
2、 37℃水浴 孵育0。5—1h。
3、 盖片在PBS（PH7。4；0。01M）中用磁力搅拌器洗涤15分钟。
4、 取出盖片置架上；滴加工作浓度己测定的荧光第二抗体。
5、 37℃孵育0。5—1h。
6、 洗涤15分钟。
7、 取出盖片，用延缓荧光猝灭的封载剂封存于干革命净玻片上。
8、 在荧光显微镜下观察：
阳性结果：可在细胞 浆，或细菌外周，或细菌粘附素鞭毛等可见特异性荧光（FITC为黄绿色荧光）。
成功范例：粘附素单抗检验，O抗原单抗检验、NDV单抗检验、NDV诊断等。
附一：活细胞的膜荧光染色
1、 在小试管中加入100ul单细胞悬液后，再加100ul第一抗体，并混匀。在冰浴上孵育30—60分钟。
2、 将细胞 重新悬殊浮1—5ml洗涤剂中，以400g离心5分钟洗涤，重复一次。
3、 以100ul洗涤剂悬浮，加工厂100ul荧光抗体，置冰浴30—90分钟。
4、 洗涤2次
5、 将细胞 重新悬浮于20—30ul含水量10％ 甘油，10—100ug苯二胺（）ml的洗液中（PH7。0左右）滴于载玻片上；加盖玻片封载。
6、 立即在显微镜下检查；细胞亦可在染色后用1％多聚甲醛生理盐水固定；立即检查；或至少在4℃可保存一周。
成功范例：NDV单抗膜荧光染色
附二：
1、双重染色：标本中有两种不同抗原；可用FITS和RB200；分别标记 两种抗体；同时或先后反两种荧光抗体进行染。 2、反衬染色：对于组织标本，为了加强特异性荧光的鲜明性，常需使用反 衬染色。最常用者为伊文氏蓝（1：10000—1：100000），它发射红色荧光，可反衬出FITC的黄绿色荧光。
附三：
1、 PH7。4 0。1M磷酸缓冲液
Na2HPO4。12H2O 28。94g
KHPO4 2。6g
DW 1000ml
应用时取上述贮存液100ml；加入NaCL8。5g；加DW至1000ml；即为PH7。4 0。01M PBS。
2、缓冲甘油
SoL。Ι
甘油（A。R。） 9份
PBS 1份
SoL Ⅱ
甘氨酸 0。42g
NaOH 0。021g
NaCL 0。51g
NaN 0。03g
D。W。 至30ml
加入 70ml
第二节 直接免疫荧光试验
1、 抗原制备同前
2、 加染荧光素标记的特异抗体。
3、 37℃温育30—60分钟。
4、 洗涤15分钟。
5、 取出盖片，完全干燥后，用封片油封于干净的勒玻片上。
6、 镜检
成功范例：沙门氏菌快速检验，NDV诊断。
第三节 荧光抗体的制备
一、 试剂
1、 PH9。3碳酸盐缓冲液
无水Na2CO3 8。6g
NaHCO3 17。3g
D。D。W 1000ml
2、 PBS（PH7。4，0。01N）同前
3、 二甲基亚砜
二、标定程序
1、 以碳酸盐缓冲液调整蛋白浓度至10mg/ml；（腹水单抗可直接用碳酸盐缓冲液稀释；提纯的抗体IgG，需经SephadexG25柱层析或透析方法转换缓冲体系至碳酸盐缓冲液）。
2、 取代5ml抗体溶液于10ml小烧杯内，磁棒轻搅。
3、 称取1mlFITC溶解于0。2mlDMS中。
4、 待溶解后立即缓慢滴加于抗体液内。
5、 20℃闭光作用2h，可不搅拌。
6、 将交联反应后的溶液经SephadexG25或G50柱析层除去游离的荧光素。
7、 收集第一峰为标记的抗体。
三、FITC结合物质量鉴定
1、 测定F/P比值：
OD100…0。35XOD495
＇IgG＇（mg/ml）=——————
1。4X
F/P=2。87
抗IgG荧光抗体F/P比不宜高于1…2；抗细菌荧光抗体F/P可允许高于2，乃至高标记（F/P10——15）。
2、 特异性及效价测定
以标记抗体染色各种抗原的盖片，同时测定其特异染色滴度和非特异染色滴定，并观察抗体活性。
四、标记抗体的保存
标记抗体宜保存于4℃；
或加50％甘油（A。R），…20℃冻存。
成功范例：沙门氏菌O抗原单抗标记，羊抗鸡IgG的标记抗体的制备等。
第六章 间接血凝试验的程序
第一节 脂多糖敏化甲醛化绵羊红细胞的制备
一、 甲醛化绵羊红血球制备：
（一） 醛化血球试剂：
1、PH7。2 PBS
NaHPO4。12H2O 3。5816g
KH2PO4 0。4082g
NaCl 8。014g
D。W。 1000ml
3、 双倍离子强度的PH7。2PBS
Na2HPO4。12H2O 0。3581g
KH2PO4 40。82g
NaCl 0。814g
D。W。 50ml
4、 抗凝保存液（即Alsever氏液）
枸椽酸钠 0。8g
枸椽酸辣 0。055g
氯化钠 0。42g
葡萄糖 2。05g
D。W。 1000ml
5、 甲醛（A。R。或C。P。）：临用前用双倍离子强度的PBS作对稀释；配成20％的甲醛。
6、 饱和硫酸铵溶液：按25℃饱和溶解度配制。
（二）、步骤：
1、 无菌采集绵羊颈静脉血50ml，用要枸椽酸钠作抗凝剂；
2、 用5倍于红细胞压积的PH7。2PBS充分洗涤5次；每次1500rpm5___10分钟；直至上清测定无蛋白质（用饱和硫酸铵滴定上清；观察有无白色沉淀）；再以相同缓冲液配制成25％SRBC悬液；
3、 25％SRBC与20％甲醛以25：1的比例混匀；37℃水浴作用2小时；每15分钟振荡一次；红细胞颜色由红色转变为棕色；
4、 取出；以PH7。2PBS洗涤4次；每次2000rpm10分钟；再加同样的PBS；制成25％SRPB；
5、 重复第三步醛化一次；同法洗涤；
6、 最后配制相当于20％醛化SRBC悬液；并加入侵。3％甲醛（最终浓度）或者0。01％硫柳汞防腐；分装；4℃保存备用。
二脂多糖抗原制备___热酚水法
1、 菌泥悬浮于100ml水中，或20g菌粉悬于350ml水中；
2、 将新配的90％（V/V）苯酚（最好是新蒸的）预热至68℃—70℃；
3、 加酚液于菌液中，至酚的最终浓度为45％，68℃水浴作用25分钟，并充分振荡；
4、 冷却至10℃左右，12000rpm30分钟，离心管内分层情况依次是：水层、蛋白质层、酚层和沉淀物。
5、 小心吸取上清，（准备透析袋）
6、 余下部分再加水80ml，68—70℃水浴维持30分钟，冷却至0℃左右，离心吸水层；
7、 将水层提取物装入透析袋，流水透析1天，蒸馏水透析2天；
8、 收集粗品LPS，冻存备用。
三、蒽酮比色定糖法—测定粗制LPS的多糖含量。
1、 原理：蒽酮可以和游离的或多糖中存在的己糖果，醛戊糖及己糖果醛 酸起反应，反应后溶液显蓝绿色，于620nm处有最大吸收。
2、 试剂：
（1） 2g/L蒽酮试剂 ：溶解2克蒽 酮于浓硫酸（A。R。 d=1。84；95％）；宜当日配制使用。
（2） 0。1g/L葡萄糖溶液或0。1g/L糖元溶液。
3、实验步骤
（1） 标准曲线制备
管号 1 2 3 4 5 6 7 备注
标准葡萄糖液 0。05 0。10 0。20 0。30 0。40 0。60 0。80 置水浴中
蒸馏水 0。95 0。90 0。80 0。70 0。60 0。40 0。20 置水浴中
蒽酮试剂 3。0 3。0 3。0 3。0 3。0 3。0 3。0
沸水浴 蒽酮 加入后，将试管移入沸水浴 ，煮沸10分钟，冷却至室温
测定OD820值
含糖量 5 10 15 20 25 30 35
绘制标准曲线：以OD820为纵坐标，糖含量（ug/ml）横坐标绘制标准曲线。
或以统计方法，求出糖含量与OD820之间的相关系数，及直线回归方程。
（2）样品含糖量测定：
取1ml稀释的粗制LPS，加速度。3。00蒽 酮试剂；混匀后迅速置于冰浴 冷却。然后转入沸水浴 中煮沸10分钟表（与制备标准曲线同时进行）。冷却至室温后，测定OD820，从标准曲线中查找相应糖含量，或代入回方法求得糖果含量。
四、脂多糖抗原致敏甲醛化SRBC
1、 取粗制LPS，加0。2M PH8。0 PB液；调整多糖浓度至120ug/ml；100℃水浴 1小时。
2、 冷却至少37℃；
3、 配制6％醛化SRBC溶液；
4、 将热处理LPS与醛化SRBC等量混合；37℃搅拌作用45分钟；
5、 取出离心2000rpm10分钟；以0。01M PH7。2PBS洗澡4次；
6、 配制4％致敏血球；分装；保存于4℃备用。
7、 致敏血球质量鉴定：
（1） 自凝性测定：血球制备过程中，洗涤不彻底，或过度化等，都可引起血球的自凝。
（2） 特异性测定：与不同抗体试剂反应，确定其反应特性。
（3） 工作浓度测定 ：选择最佳最省的致敏SRBCIPYA。
附0。2MPH8。0PB溶液。
基础液A 0。2Mna2HPO4
Na2HPO4。2H2O（MW353。22） 35。61g
或 Na2HPO4。12H2O（MW352。22） 71。6g
DW 1000ml
基础液B 0。2M NaH2PO4
NaH2PO4。H2O（MW138。01） 27。6g
或NaH2PO4。2H2O（MW156。03） 31。21g
DW 1000ml
使用液： A液94。7ml ＋B液5。3ml
成功范例：沙门氏菌脂多糖抗原敏化SRBC制备；及其在单抗检测、鸡白痢等检疫中的应用。
第二节 蛋白质敏化SRBC的制备
一、 双醛化红细胞制备
1、 采绵羊抗凝血；
2、 用10倍于红细胞 压积的0。11MPBS（PH7。2）洗4—6遍；
3、 用同一PB配成8％SRBC；
4、 配制醛 化试剂：
丙酮醛 3ml
甲醛 6ml
0。11MPB液（PH7。2） 94ml
5、 将醛化试剂缓慢加入等到量的8％SRBC中；
6、 室温（20℃）缓慢搅拌17小时；
7、 PB洗三次；
8、 配成20％双醛化SRBC，加0。1％NaN2防腐；4℃保存备用。
附：醛化红细胞 的鞣酸处理亦能吸附蛋白；但其敏感性很低；经鞣酸化�